示意文章-1

       在化妆品制造业持续不断发展的情形下，可用于制作 化妆品的原材料种类不断增加，化妆品配方使用的 原料数量也持续增加，因此化妆品安全风险越来 越高。根据我国国家卫生和计划生育委员会（原卫生部）化 妆品不良反应监测网络的资料，化妆品过敏或刺激导致的接 触性皮炎占到了化妆品皮肤病的90%以上[1]。为尽可能降低化 妆品制作及使用的安全风险，使产品更加温和, 各大化妆品公 司纷纷在配方中添加植物提取物、活性多肽等抗皮肤过敏的 活性成分，起到预防和舒缓作用。例如，法国宣尔雅化妆品 在配方中添加洋甘菊以提高肌肤免疫防御能力，欧美等国家 将北美金缕梅提取物添加到化妆品中以促进皮肤过敏皮炎修复[2]。值得指出的是，“防敏”、“安全无刺激”、“温和不刺激” 等词汇是化妆品备案禁用词，但是国家食品药品监督管理局 注意到了上述市场变化，监管政策将会有所调整。2020年9月 公布的《化妆品功效宣称评价指导原则》（征求意见稿）明确了 “宣称适用于敏感皮肤（肌肤）”、“宣称温和（无刺激）”的功 效评价原则，各企业将在其指导下开展评价试验和产品研发。

      化妆品相关的皮肤过敏反应临床表现多为局部的皮肤 瘙痒、刺痛、红肿、脱屑、灼热感、紧绷感等[3]，主要涉及I 型过敏反应和IV型过敏反应两类，其反应原理如图1、图2所示。I型过敏反应是指已致敏的机体再次接触相同抗原后在数 分钟内所发生的超敏反应，其主要特点是发生快、消退也快， 通常只是导致机体生理功能紊乱，极少引起组织损伤。IV型 过敏反应是由致敏T细胞与相应抗原作用后，引起的以单个核 细胞浸润和组织细胞损伤为主要特征的炎症反应。已有研究 表明，无论是针对I型过敏反应，还是IV型过敏反应，抗敏活 性物的作用机制都主要通过抑制过敏介质在过敏反应过程中 的释放，或者拮抗过敏介质的作用产生抗过敏效果[4]。

       目前，针对抗敏性活性物的抗敏性测定研究较多，其 包括体外实验、动物试验、细胞试验以及人体试验，但大多 数研究只是综述抗敏测定方法以及从功效方面比较抗敏测定 方法，而从过敏反应机理上综述抗敏测定方法的研究较少。 因此，本文从过敏介质的角度，分类综述了近年来化妆品抗 敏安全性评价模型的研究进展，以期为抗过敏原料的筛选和 温和化妆品的研究开发提供一定的理论依据。

1 组胺为靶点的测评模型

      组胺是通过组氨酸脱羧酶，由L-组氨酸合成的一种低分 子量胺，组氨酸脱羧酶是一种在全身表达的酶，包括肥大 细胞、胃壁细胞和中枢神经系统。组胺是I型过敏反应的重 要介质，从抗原与肥大细胞表面上的IgE抗体相互作用中释 放，具有许多重要的生理作用，可引起毛细血管扩张及通透 性增加、平滑肌痉挛以及分泌活动增强等，临床上导致局部 充血、水肿[5]，其作用机理图如图3[6]所示，它可直接刺激皮 肤，导致皮肤出现过敏现象。

组胺的多种生物学效应是通过4种类型的组胺受体介导 的， 即H1受 体（H1R）、H2受 体（H2R）、H3受 体（H3R） 和H4受体（H4R）（图3）[7]。而与皮肤过敏有关的是H1R和 H4R受体。H1R激活介导了许多I型过敏反应症状，包括瘙 痒、红斑和水肿。实际上，H1R拮抗剂已用于这些过敏症状 的局部和全身治疗[8]。H4R参与过敏性疾病的发生也已被证 实。例如，与H1R和H4R拮抗剂联合治疗可防止花生过敏实 验模型中腹泻和肠道炎症的发生；在过敏性皮炎的实验模型 中，与野生型小鼠相比，H4R敲除小鼠的皮肤病变更少，尽 管在致敏和激发过程中都需要对H4R进行药理学阻断才能部 分模拟在H4R敲除小鼠中观察到的结果[9]。

       目前已有大量针对抑制组胺的抗过敏化妆品原料上 市，如德国SYMRISE公司的Symcalmin•德敏舒、青海湖 药业的甘草酸二钾以及法 国SEQENS（艾比 欧）公司的 Sens’flower• SD-SC藏红花舒敏因子、浙江湃肽生物有限 公司的ZPC•Anti-allergy074S抗敏修复肽原液等，这些原料 都被宣称对组胺引起的刺激有良好的抑制作用。因此，抑制 组胺释放是抗敏功效化妆品的直接手段，而以组胺为靶点的 测评模型比较多，涉及到生化反应、细胞实验、动物实验以 及人体实验等方面，例如以组胺H3R为靶点的细胞实验[10]和 以H1R和H4R为双靶点的动物实验[11, 12]。

  1.1 透明质酸酶抑制模型

       研究发现，肥大细胞释放的组胺可导致透明质酸酶活 性的增加，组胺的释放量就越高，透明质酸酶活性就越高， 过敏反应也就越强烈[13]。因此，透明质酸酶活性抑制和肥大 细胞释放组胺抑制活性之间具有很好的相关性，通常用透明 质酸酶体外抑制模型来测定抗敏性。近年来，国外学者对透 明质酸酶抑制模型进行了大量研究，生物碱、多酚、类黄酮

（芹黄素，木犀草素，槲皮素，山奈酚和芦丁）和萜类化合 物都已被证明具有透明质酸酶抑制性[14-16]。国内学者也进行 了一系列研究，王领[17]用透明质酸酶体外抑制模型筛选了仙 人掌提取物等10种提取物，发现仙人掌、马齿苋、苦参提取 物在同等浓度下具有很好的抗敏功效；刘超[18]研究了中药射 干中鸢尾苷的抗透明质酸酶作用，发现鸢尾苷纯化物II具有 良好的抑制透明质酸酶作用，表明鸢尾苷具有良好的抗致敏 性。这些研究表明透明质酸酶抑制率是用作评估物质抗敏功 效的有效指标。

  1.2 以组胺为靶点的细胞实验

      以组胺为靶点的细胞实验较多，有大鼠腹膜肥大细胞脱颗粒模型以及二甲苯小鼠耳肿胀实验模型。大鼠腹膜肥大 细胞脱颗粒模型是模拟肥大细胞释放组胺过程，通过在大鼠 腹腔给药后分离腹腔肥大细胞，细胞染色后在显微镜下观察 明显脱颗粒细胞的百分数来表征药物抗敏功效。ASHWINI 等[19]利用大鼠腹膜肥大细胞脱颗粒模型研究了多草药制剂 Bresol•对肥大细胞脱粒和肥大细胞中组胺释放的保护作用， 评估了Bresol•对化合物48/80诱导的肥大细胞脱粒和组胺从 大鼠腹膜肥大细胞释放的肥大细胞稳定作用，发现其制备的 草药复方制剂Bresol•对肥大细胞脱粒和肥大细胞中组胺释 放的保护作用可有效抑制化合物48/80诱导的组胺释放。二 甲苯诱导的小鼠耳肿胀模型主要通过促进组胺等炎性介质的 释放，刺激局部毛细血管扩张和炎性细胞浸润加重，引起耳 部出现急性渗出性水肿。张志红等[20]使用二甲苯小鼠耳肿胀 实验模型研究了秦艽及秦艽不同配伍对炎症早期实验性渗 出、肿胀的影响，发现秦艽配伍制川乌组、秦艽配伍桑寄生 组的小鼠耳廓肿胀度均显著降低。因此，动物实验是最广泛 使用的抗过敏功效评估方法，然而动物实验过程相对繁琐， 且欧盟2013年起禁止使用动物进行化妆品原料评价，所以并 不常用于化妆品中有效成分的研究。

   1.3 组胺人体刺激实验模型

       组胺人体刺激实验模型是将盐酸组胺施加于人体皮肤 表面，待皮肤刺激产生泛红、水疱、瘙痒后，再涂抹抗过敏 成分，观察红斑、瘙痒的消退情况。SYMRISE公司采用特 定的试验刀片在皮肤试验部位滴加盐酸组胺(10 mg/mL)，待 皮肤产生水疱及痒感，应用试验产品(2 mg/cm2)，在应用试 验产品后的30、60、90、120、150 min后测定试验部位的瘙 痒感、红肿度及水疱面积，实验结果显示SymCalmin•德敏 舒可明显减轻由组胺引起的皮肤异常状况，如瘙痒、红肿及 水疱，并且存在剂量依赖性。尽管个体之间的差异会导致实 验存在差异，但是每个个体对皮肤的敏感程度不同，并且皮 肤对产品的反应方式将决定他们是否继续使用该产品，所以 仍然认为人体试验是有价值的评估方法[21]。

2.1 UVB 致细胞光损伤模型

        UVB照射可引起皮肤发生急性炎症，表皮角质形成细 胞经UVB直接刺激后，会释放大量炎性介质，使毛细血管 扩张，即皮肤出现红斑[24]。在此过程中，COX-2对于炎症 的发生具有重要影响，它是环氧化酶的一种亚型，是分解 AA生成各种内源性前列腺素（PGE2）过程中的关键限速 酶，其可引起受损部位炎性因子前列腺素（PGE2）合成 和聚积[25]，促进炎症反应和组织损伤。因此，COX-2可作 为研究皮肤炎症反应的一个有研究价值的指标。UVB致细 胞光损伤模型是培养表皮角化细胞，用不同剂量UVB照射 细胞致其损伤，然后检测UVB受损细胞中各过敏介质的含 量。卓金士[26]研究了UVB致细胞光损伤模型，发现虎仗苷 降低了UVB损伤模型中凋亡基因和炎症基因的表达，如降 低了p53、caspase-3、baxmRNA的表达，抑制了IL-6，IL-18 等炎症基因的表达，同时还降低了基质金属蛋白酶MMP-1 的表达。IRB公司预先用不同浓度的GPI处理人表皮角化细 胞24 h，后将细胞暴露于UVB (25 mJ/cm2)的照射下，测定 前列腺素PGE2的分泌水平，发现GPI能显著抑制表皮角化 细胞中由UVB引发的前列腺素PGE2分泌，缓解炎症反应。 何咏[27]研究了矢车菊素-3-葡萄糖干预UVB损伤HaCaT细胞 ROS/COX-2通路，发现UVB通过诱导ROS的产生增多，激 活EFGR，从而促进ERK、p38、JNK和Akt的磷酸化，调节 COX-2的表达，减少炎性因子前列腺素（PGE2）的合成， 从而减少皮肤红斑。

2.2 AA 诱导小鼠耳肿胀模型

     AA诱导小鼠耳肿胀模型被广泛使用，其主要被白三烯 和其他脂肪氧化酶介导，而在白三烯存在的情况下前列腺 素（PGE2）会更促进小鼠耳肿胀[28]。黎丽等[29]利用AA诱导 小鼠耳肿胀模型研究了角蒿咖啡酸酯的抗敏功效，发现其能 显著抑制AA所致的小鼠耳肿胀程度和组织蛋白渗出量，并 降低小鼠发炎耳组织中白三烯B4的生成量。BHAT等[30]通过 动物实验证实白藜芦醇可以抑制COX-1而致PGE2合成减少， 对小鼠炎症模型具有良好抗炎作用。曹雯[31]通过建立花生四 烯酸诱导的小鼠耳肿胀模型，研究了THCA354化合物抑制 花生四烯酸诱导的急性炎症反应，结果表明实验组和阳性对 照组均能有效地抑制小鼠耳肿胀。

2.3 AA 诱导的血小板聚集模型

       AA诱导的血小板活化因子（PAF）为一种血小板聚集 激活剂，可促进血栓形成，诱发炎症反应[32]。PAF介导的血 小板聚集模型的机制是PAF介导下致血小板凝聚现象。臧宝 霞等[33]发现红花活血化瘀的有效部位羟基红花黄色素A以及 杨梅素均为抗PAF的有效成分，可抑制PAF与兔血小板受体 的特异性结合，明显抑制了PAF诱发的血小板黏附。

3 IgE为靶点的测评模型

IgE是由B淋巴细胞产生的分子量为190 kD的免疫球蛋 白，是过敏反应的主要参与者，其活性与蛋白质网络有关， 其结构示意图见图5[34]。IgE有2种受体：在B细胞以及其他造 血细胞表面表达的低亲和力IgE受体（FcεRII，CD23）和高亲 和力IgE受体（FcεRI）。FcεRI在肥大细胞和嗜碱性粒细胞 上以四聚体（αβγ2）的形式表达，并在抗原呈递细胞上以三 聚体（αγ2）的形式表达。人嗜碱性粒细胞FcεRI表达的密度 与血清IgE水平直接相关，其中IgE的结合稳定了细胞表面的 受体，FcεRI亚基没有已知的酶活性，而是通过相关的细胞 质酪氨酸激酶发出信号[35]。已有大量证据表明，IgE和肥大 细胞也是哮喘和其他环境中的慢性过敏性炎症相关的长期病 理生理变化和组织重塑的关键驱动力。这些潜在的作用包括 肥大细胞功能的IgE依赖性调节，很大程度上独立于肥大细 胞的IgE的作用以及不直接涉及IgE的肥大细胞的作用[36]。因 此，以IgE信号通路为靶点设计药物，阻断IgE与其高亲和力 受体(Fc)的结合及下游信号传递是目前变态反应性疾病药物 研究的热点。

       Kelly等[37]研究表明通过FcεRI激活肥大细胞是过敏性疾病 发病机理的关键，导致皮肤红斑、浮肿和瘙痒，可以通过皮 肤测试或血清中过敏原特异性IgE的测定来确定。易斌等[38]采 用HITACHI 7170A全自动生化分析仪对检测1 100例过敏性 皮肤病患者血清总IgE值，研究发现53%的过敏性皮肤病患 者血清总IgE升高，其中以湿疹和接触性皮炎最为明显，表 明血清IgE在大多过敏性皮肤病的发生、发展中起到一定的 推动作用。王永奇等[39]以IgE为活性指标研究了金花茶组植 物抗IgE介导I型过敏反应的活性，结果表明金花茶组植物 均能明显降低大鼠血清IgE和LT的含量，明显减少全血中的 EOS数量，减小肺组织炎症面积。青海湖药业分别用甘草 酸和甘草次酸处理组胺激发下的小白鼠巨噬细胞，通过测 量IgE值，发现甘草酸在1 mg/mL浓度下抑制效果可以达到 83.4%，明显优于甘草次酸。

4 细胞因子为靶点的测评模型

     细胞因子是由免疫细胞分泌的多肽或者糖蛋白，受到 NF-κB信号通路调控，通过与特异性受体结合作用于靶细胞而 发挥生物学作用[40]，其在IV型过敏反应中起关键作用（图2）。 主要类别有肿瘤坏死因子：TNF-α、TNF-β，白细胞介素： IL-1α、IL-6、IL-8，集落刺激因子G-CSF、GM-CSF等。

4.1 TNF-α 刺激的角质形成细胞模型

     角质形成细胞既可产生多种细胞因子，又是多种细胞 因子作用的靶细胞，在皮肤免疫反应中有重要意义。何荣安 等[41]将终浓度为10 ng/mL的TNF-α加入到细胞培养基中，联 合20 μmol/L瑞香素处理，发现能减弱TNF-α刺激角质形成 细胞所引起的炎症因子表达升高。胡惠清等[42]采用酶联免疫 吸附试验（ELISA）发现蜕皮甾酮对TNF-α刺激角质形成细胞后炎症因子的产生有抑制作用。

4.2 脂多糖（LSP）诱导 RAW264.7 巨噬细胞模型

    脂多糖（LSP）是最常见且危害性最大的一种致炎因 子，由亲水性的O-特异性抗原多糖、类脂A、核心多糖及 特异性侧链四部分所组成，其中类脂A由葡糖胺、磷酸盐及 脂肪酸组成，是LSP的毒性中心和主要生物活性部分。LSP 作用于RAW264.7诱导炎症反应的机制是，形成LSP-LBP- SCD14复合体作用于TLR4，并激活NF-κB和MAPKs信号通 路，诱导的RAW264.7巨噬细胞中iNOS和COX-2的mRNA表 达，促进炎性基因iNOS，COX-2的转录，增加促炎性细胞 因子如TNF-α，IL-6和IL-1β的释放[43]。姚茹[44]建立了LPS 诱导的RAW264.7巨噬细胞模型，采用莲心碱预处理后可显 着降低TNF-α，IL-6和IL-1β的含量，进一步提示莲心碱的 抗炎作用。汪娟等[45]在脂多糖刺激的巨噬细胞模型上，筛选 分离降香活性化合物，得到的活性化合物能抑制脂多糖诱导 RAW264.7分泌的细胞因子TNF-α的释放。

4.3 佛波酯（TPA）致小鼠耳肿胀模型

   TPA致小鼠耳肿胀模型的主要机能诱导小鼠耳组织角 质形成细胞产生TNF-α，IL-1β等炎症细胞因子。TNF-α 的存在会促进继发性炎症细胞因子生成，促使炎症反应进 一步扩大，继而刺激磷脂酶诱导AA释放，代谢成为PGE2和 LTB4，促进组胺和5-羟色胺的释放，加重炎症。何勤敏[46]利 用TPA致小鼠耳肿胀模型发现屏边三七总皂苷可抑制炎症介 质NO、PGE2、TNF-α的分泌，显著降低TPA诱导的小鼠的 耳组织的水肿、毛细血管扩张和炎性细胞浸润现象。彭奕[47] 通过TPA诱导的小鼠耳廓肿胀模型，评价了活性酵母细胞代 谢物的抗炎活性及机理研究，研究发现，活性酵母细胞代 谢物可明显抑制TPA诱导的小鼠耳廓角质层增厚和炎症因子 COX-2的表达及NF-кB通路的活化，其抑制率高达54.46%。

5 辣椒素受体（TRPV1）通路为靶点的测评模型

辣椒素受体（TRPV1）广泛分布于哺乳动物的感觉神 经纤维，是一种非选择性的阳离子通道[48]。TRPV1被激活 时，能引起Ca2+、Mg2+和Na+等阳离子内流，但对Ca2+和Mg2+ 有相对选择特异性，TRPV1激活后使胞内阳离子浓度升高， 引起相应的生理和病理变化（图6）[49]。TRPV1可以被多种 神经炎症介质和内源性炎症介质如缓激肽、P物质、前列腺 素、神经生长因子和降钙素基因相关肽(CGRP)等直接或间接激活[50]。CGRP是第一个通过基因重组和生物合成的神经 多肽，由37个氨基酸组成，TRPV1是调节CGRP合成与释放 的关键受体。

5.1 辣椒素诱导的小鼠耳水肿模型

       辣椒素诱导的小鼠耳水肿模型是将一定剂量的辣椒素 注射到小鼠耳朵，在降钙素基因相关肽、P物质、神经激肽 A和血管活性肠肽等神经肽介导下发生肿胀。SARAIVA等[51] 利用辣椒素诱导的小鼠耳水肿模型评估果皮提取物的局部抗 炎作用，结果发现其能够减轻小鼠耳朵的水肿。

5.2 辣椒素人体刺激实验模型

     辣椒素人体刺激实验模型是将辣椒素和待测样品混合 施加于人体皮肤表面，观察皮肤刺痛、灼热及消退情况。 SYMRISE公司将含有31.6 mg/kg辣椒素和1%活性物的水包油 乳液涂抹在志愿者鼻唇沟位置，与只含辣椒素的样品对照， 发现1%活性物能显著降低辣椒素引起的刺痛和灼热感。

6 其他测评模型

《化妆品安全技术规范》（2015版）第7章提供了人体皮 肤斑贴实验、人体试用试验安全性评价的方法，以检测受试 物引起人体皮肤不良反应的潜在可能性。另外，还可通过测 量志愿者使用产品前后皮肤生理功能指标，如经皮水分丢失 TEWL、含水量、pH值、Lab值等，对于评价和验证抗过敏 原料和化妆品对于人体的实际效果有重要参考意义[52]。

7 结束语

近些年，由于生态环境恶化、各类工业添加剂滥用等 原因，许多人皮肤处于亚健康状态，表现为皮肤耐受力低 下，易受到各种物理化学因素的刺激过敏而产生刺痛、烧 灼、紧绷、瘙痒等感觉。在化妆品中添加抗敏活性成分，尽 可能避免化妆品原料因素带来的不利影响，降低对上述人群

肌肤的刺激具有重要意义，而这也越来越受到研发工程师和 消费人群的重视。因此，深入探索过敏反应机理，寻找合适 的抗敏安全性测评方法对于抗敏化妆品原料的筛选以及化妆 品研发体系具有重要意义，将促进化妆品行业的发展。